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猪的白细胞介素10ELISA试剂盒Porcine IL- 10 ELISA KIT
货号:HP-03
价格:¥3400.00/2120.00.00
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白细胞介素10定量分析酶联免疫检测试剂盒

 

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测猪血清、血浆或细胞培养上清液中的IL-10浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整, 如有产品包装破损或质量投拆,请在收到货一个月之内联系我们。

 

IL-10简介:

IL-10是个多效性的因子,能够对多种细胞起作用,主要表现为免疫抑制和免疫刺激两方面的作用,特别是在调节淋巴系和髓系的细胞功能方面扮演重要的作用。IL-10 也具有单核细胞/巨噬细胞依赖、抗原刺激引起的的PBMNC  NK 细胞合成其它细胞因子的抑制作用。巨噬细胞膜介导的共刺激引起的T细胞和NK细胞活化后的产物及功能也可被IL-10所抑制。IL-10是单核细胞/巨噬细胞功能的强有力的调节物。IL-10作为细胞介导的免疫反应的抑制物,能够抑制像前列腺素E2、TNF-α、IL-1IL-10 IL-8等许多引起炎症的细胞因子。IL-10 能够促进可溶性TNF受体的释放和ICAM-1和B7在细胞表面的表达。IL-10还参与B细胞、柱状细胞及胸腺细胞的增殖和分化的调控。在许多与寄生虫感染的报道中,IL-10表达也会增加,如曼森氏血吸虫感染、利什曼原虫感染、弓形虫感染、锥虫感染等。分枝杆菌的感染如麻风分枝杆菌结核杆菌 鸟分枝杆菌等的感染也会引起IL-10的表达升高。

IL-10DNA序列和氨基酸序列上高度同源,其DNA序列中一个开放的基因框与艾伯斯坦-巴尔病毒基因组上基因框BCRF1高度同源,这可能在病毒感染中扮演重要角色的原因。在许多与寄生虫感染的报道中,IL-10表达也会增加,如曼森氏血吸虫感染、利什曼原虫感染、弓形虫感染、锥虫感染等。分枝杆菌的感染如麻风分枝杆菌结核杆菌 鸟分枝杆菌等的感染也会引起IL-10的表达升高。

 

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-10 的浓度。IL-10 捕获抗体已预包被于酶标板上,当加入标本或参考品时,其中的IL-10 会与捕获抗体结合,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗猪IL-10 抗体后,抗猪IL-10 抗体与IL-10 接合,形成夹心的免疫复合物,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合,亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来;其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂,若样本中存在IL-10 将会形成免疫复合物,辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质,在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测,读其450nm处的OD值,IL-10 浓度与OD450值之间呈正比,通过参考品绘制标准曲线,对照未知样本中OD值,即可算出标本中IL-10 浓度。

 

IL-10定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

组分

规格(96T/48T)

猪IL-10预包被板

12条/6

样本分析缓冲液

5ml/3ml

标准品稀释液

10ml/5ml

猪IL-10标准品

2支/1支(冻干)

猪IL-10生物素化抗体

10ml/5ml

亲和素连接的HRP酶

10ml/5ml

浓缩洗涤液 20×

30ml/15ml

TMB底物

10ml/5ml

中止液

5ml/3ml

封板胶纸

3/2

说明书

1

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作;

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可;

B.血清标本应是自然凝固后,取上清,避免在冰箱中凝固血液;

C.血浆标本,推荐用EDTA的方法收集;

D.若待测样本不能及时检测,标本收集后请分装,冻存于-20℃,避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂;

3.标本应清澈透明,检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血,高血脂或污染的标本检测,否则结果将不准确。

注:猪血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。

 

注意事项:

1.试剂盒请保存在28℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶,请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后,剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时,请及时更换枪头,避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要,在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应,请严格控制在25~28℃。

9.洗涤过程是至关重要的,洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时,检测抗体的孵育时间应适当延长。

 

检测前准备工作: 

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温(25-28℃)平衡20分钟;每次检测后剩余试剂请及时于2~8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)

3.如有5X准品稀释液,请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)

4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使IL-10终浓度达到1500pg/ml,室温反应,请严格控制在25~28℃,静置10~15分钟后轻轻混悬(建议抽吸几次)待彻底溶解,用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。(标准曲线取七个点,最高浓度为1500 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.)

图片2.png 

洗涤方法:

自动洗板机或猪工洗板:每孔洗涤液为300ul,注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

 

实验过程需自备的材料:

1.不同规格的加样枪及相应的枪头;   

2.酶标仪;

3.自动洗板机;                     

4.去离子水或双蒸水;

 

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数,取出所需板条放置在框架内,暂时用不到板条请放回铝箔袋密封,保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔,即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中,用封板胶纸封住反应孔,室温(25-28℃)孵育120分钟。对于血清或血浆标本,请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本,如稀释量大,请将样本与样本分析缓冲液等量加入,不足部分用标准品稀释液补充至100ul。    

4.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/)。用封板胶纸封住反应孔,室温(25-28℃)孵育60分钟。   

6.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/)。用封板胶纸封住反应孔,避光室温(25-28℃)孵育20分钟。

8.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入显色剂TMB100ul/孔,避光室温(25-28℃)孵育20分钟。

10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

 

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效,复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测,计算浓度时应乘以稀释倍数。

典型数值和参考曲线

浓度pg/ml

典型OD1

典型OD2

OD平均值

0

0.114

0.094

0.134

46.875

0.263

0.256

0.27

93.75

0.391

0.385

0.397

187.5

0.557

0.527

0.587

375

0.975

0.954

0.996

750

1.478

1.446

1.51

1500

2.374

2.243

2.505

IL-10参考标准曲线

图片1.png 

注意:本图仅供参考,应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

 

灵敏度,特异性和重复性:

1.灵敏度:多次重复结果表明,最小检出量为34.5pg/ml

2.特异性:与人、小鼠、大鼠的IL-10及猪的IFN-γ均无交叉反应性。

3.重复性:板内,板间变异系数均<10%.

 

参考文献:

1. Sennikov, S.V. et al. (2002) Cytokine 17:221.

2. Kotenko, S.V. et al. (1997) EMBO J. 16:5894.

3.. Gruenberg, B.H. et al. (2001) Genes Immun. 2:329.

4. Rich, B.E. and T.S. Kupper (2001) Curr. Biol. 11:R531.

5. Fickenscher, H. et. al. (2002) Trends Immunol. 23:89.

6. Rea, D. et al. (2000) Blood 95:3162.

7. Olikowsky, T. et al. (1997) Immunology 91:104.

8. Iwasaki, A. and B.L. Kelsall (1999) J. Exp. Med. 190:229.

9. Moore, K.W. et al. (2001) Annu. Rev. Immunol. 19:683


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