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人血管细胞粘附蛋白1ELISA试剂盒Human VCAM-1 ELISA KIT
货号:HH-92
价格:¥3800.00
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人血管细胞粘附蛋白1定量分析酶联免疫检测试剂盒

 

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的VCAM-1浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整,如有产品包装破损或质量投拆,请在收到货一个月之内联系我们。

 

VCAM-1简介:

人血管细胞粘附蛋白1VCAM1),也叫CD106,属于免疫球蛋白家族的粘附分子。VCAM1715个氨基酸构成的I型跨膜糖蛋白,胞外部分674个氨基酸,跨膜部分22个氨基酸,胞内有19个氨基酸的尾巴。根据不同种裂解方式,VCAM1胞外部分有6Ig样结构域和7Ig样结构域的两个类型。VCAM1 可以在不同种类细胞表面表达,这些种类的细胞包括活化的内皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞、神经元细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和卵母细胞等。

VCAM1与整合素α4β1 (VLA4) α4β7结合,从而发挥许多功能。这此功能包括VCAM1在白细胞的迁移、白细胞粘附内皮细胞、信号传导等生理过程中起作用。VCAM1在沉滞性动脉硬化症和风湿性关节炎中都起作用。

 

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中VCAM-1的浓度。VCAM-1捕获抗体已预包被于酶标板上,当加入标本或参考品时,其中的VCAM-1会与捕获抗体结合,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人VCAM-1抗体后,抗人VCAM-1抗体与VCAM-1接合,形成夹心的免疫复合物,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合,亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来;其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂,若样本中存在VCAM-1将会形成免疫复合物,辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质,在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测,读其450nm处的OD值,VCAM-1浓度与OD450值之间呈正比,通过参考品绘制标准曲线,对照未知样本中OD值,即可算出标本中VCAM-1浓度。

 

VCAM-1定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

组分

规格(96T/48T

VCAM-1预包被板

12/6

5X标准品稀释液

10ml/5ml

VCAM-1标准品

4/2(冻干)

VCAM-1生物素化抗体

10ml/5ml

亲和素连接的HRP

10ml/5ml

浓缩洗涤液 20×

30ml/15ml

TMB底物

10ml/5ml

中止液

5ml/3ml

封板胶纸

3/2

说明书

1

标本收集:

11.标本的收集请按下列流程进行操作;

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可;

B.血清标本应是自然凝固后,取上清,避免在冰箱中凝固血液;

C.血浆标本,推荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时检测,

D.标本收集后请分装,冻存于-20℃,避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂;

3.标本应清澈透明,检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血,高血脂或污染的标本检测,否则结果将不准确

注意事项:

1.试剂盒请保存在28

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶,请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后,剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时,请及时更换枪头,避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要,在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应,请严格控制在2528

9.洗涤过程是至关重要的,洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时,检测抗体的孵育时间应适当延长。

 

检测前准备工作: 

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温(2528)平衡20分钟;每次检测后剩余试剂请及时于28保存

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)

3.如有5x标准品稀释液,请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)

4.标准品: 按标签复溶体积加入1X标准品稀释液复溶使VCAM-1终浓度达到1000pg/ml,室温反应,请严格控制在2528,静置15~20分钟后轻轻混悬(建议抽吸几次)待彻底溶解,用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。(标准曲线取七个点,最高浓度为1000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.

图片2.png 

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板:每孔洗涤液为300ul,注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

 

实验过程需自备的材料:

1.不同规格的加样枪及相应的枪头;   

2.酶标仪;

3.自动洗板机;                     

4.去离子水或双蒸水;

 

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数,取出所需板条放置在框架内,暂时用不到板条请放回铝箔袋密封,保存于4

2.建议设置本底较正孔,即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/)加入相应孔中,用封板胶纸封住反应孔,室温(2528)孵育120分钟。如果是血清血浆样本,不同样本稀释比例不一样,一般范围在100~1000倍,如无明确范围,建议从200倍稀释,如果样本浓度过高,超过检测范围,请加大稀释倍数后重新稀释检测。

4.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/)。用封板胶纸封住反应孔,室温(2528)孵育60分钟。    

6.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/)。用封板胶纸封住反应孔,避光室温(2528)孵育20分钟。

8.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入显色剂TMB100ul/孔,避光室温(2528)孵育20分钟。

10.加入终止液50ul/,混匀后即刻测量OD450值。

 

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效,复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测,计算浓度时应乘以稀释倍数

典型数值和参考曲线

浓度pg/ml

典型OD1

典型OD2

OD平均值

0

0.0826

0.0912

0.0869

31.25

0.2751

0.2105

0.2428

62.5

0.4717

0.4133

0.4425

123

0.775

0.529

0.652

250

1.0368

1.0158

1.0263

500

1.4829

1.2923

1.3876

1000

2.0565

1.9139

1.9852

VCAM-1参考标准曲线

图片1.png 

注意:本图仅供参考,应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

 

灵敏度,特异性和重复性:

1.灵敏度:多次重复结果表明,最小检出量为26.5pg/ml

2.特异性:与人的E-SelectinVCAM-1ICAM-2ICAM-3小鼠ICAM-1没有交叉反应。

3.重复性:板内,板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Garton, K.J. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:37459.

2. Wu, T.C. et al., 2007, Cancer. Res. 67: 6003-6006.

3.. Hession, C. et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 183:163.

4. Ulyanova, T. et al., 2005, Blood. 106: 86-94

5.Terry, R.W. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5919.

6.Pepinsky, B. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 17820-17826


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