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人的肿瘤坏死因子βELISA试剂盒Human TNF-β ELISA KIT
货号:HH-88
价格:¥3800.00
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人淋巴毒素αTNF-β)定量分析酶联免疫检测试剂盒

 

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的TNF-β浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整, 如有疑问请与安徽巧伊生物科技有限公司联系,我们将提供力所能及的帮助。 

 

TNF-β简介:

淋巴毒素α,也叫TNF-β,是一个属于肿瘤坏死家族的分泌蛋白。人的TNF-β是一个22 kDa的蛋白。分泌型的TNF-β是三倍体。当然,TNF-β也能与淋巴毒素β形成三倍体,从而将TNF-β锚定在细胞表面。TNF-β由活化的B淋巴细胞分泌,对自身免疫病的发生起重要作用。

TNF-β介导不同类型的炎症反应,免疫刺激以及抗病毒等过程。TNF-β除了对肿瘤细胞的细胞毒性外,TNF-β能刺激淋巴腺及淋巴结等淋巴器官的发育,参与淋巴器官的炎症及免疫功能。TNF-β也参与次级淋巴器官的形成和生长,同时TNF-β也参与细胞调亡。TNF-β的基因多态性也会诱导牛皮癣伴随着血清阴性的关节炎,即牛皮癣性关节炎。

 

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中TNF-β 的浓度。TNF-β捕获抗体已预包被于酶标板上,当加入标本或参考品时,其中的TNF-β会与捕获抗体结合,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人TNF-β抗体后,抗人TNF-β抗体与TNF-β接合,形成夹心的免疫复合物,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合,亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来;其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂,若样本中存在TNF-β将会形成免疫复合物,辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质,在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测,读其450nm处的OD值,TNF-β浓度与OD450值之间呈正比,通过参考品绘制标准曲线,对照未知样本中OD值,即可算出标本中TNF-β 浓度。

 

TNF-β定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

组分

规格(96T/48T)

人TNF-β预包被板

12条/6

标准品稀释液

10ml/5ml

人TNF-β标准品

2/1支(冻干)

人TNF-β生物素化抗体

10ml/5ml

亲和素连接的HRP酶

10ml/5ml

浓缩洗涤液 20×

30ml/15ml

TMB底物

10ml/5ml

中止液

5ml/3ml

封板胶纸

3/2

说明书

1

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作;

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可;

B.血清标本应是自然凝固后,取上清,避免在冰箱中凝固血液;

C.血浆标本,推荐用EDTA的方法收集;

D.若待测样本不能及时检测,标本收集后请分装,冻存于-20℃,避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂;

3.标本应清澈透明,检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血,高血脂或污染的标本检测,否则结果将不准确。

 

注意事项:

1.试剂盒请保存在28℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶,请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后,剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时,请及时更换枪头,避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要,在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应,请严格控制在25-28℃。

9.洗涤过程是至关重要的,洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时,检测抗体的孵育时间应适当延长

 

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温(25-28℃)平衡20分钟;每次检测后剩余试剂请及时于2~8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)

3.如有5x标准品稀释液,请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)

4 标准品: 根据标签复溶体积加入标准品稀释液使TNF-β终浓度达到2000pg/ml,室温反应,请严格控制在25~28℃,静置15~20分钟后轻轻混悬(建议抽吸几次)待彻底溶解,用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。(标准曲线取七个点,最高浓度为2000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.)

图片2.png 

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板:每孔洗涤液为300ul,注入与吸出间隔15-30秒。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

 

实验过程需自备的材料:

1.不同规格的加样枪及相应的枪头;   

2.酶标仪;

3.自动洗板机;                    

4.去离子水或双蒸水;

 

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数,取出所需板条放置在框架内,暂时用不到板条请放回铝箔袋密封,保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔,即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中,用封板胶纸封住反应孔,室温(25-28℃)孵育120分钟。4.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/)。用封板胶纸封住反应孔,室温(25-28℃)孵育60分钟。    

6.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入HRP酶结合物工作液(100ul/)。用封板胶纸封住反应孔,避光室温(25-28℃)孵育20分钟。

8.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入显色剂TMB100ul/孔,避光室温(25-28℃)孵育20分钟。

10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

 

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效,复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测,计算浓度时应乘以稀释倍数。

典型数值和参考曲线

浓度pg/ml

典型OD1

典型OD2

OD平均值

0

0.065

0.074

0.0695

62.5

0.23

0.213

0.2215

125

0.448

0.413

0.4305

250

0.69

0.627

0.6585

500

1.096

0.975

1.0355

1000

1.588

1.428

1.508

2000

2.261

2.138

2.1995

TNF-β参考标准曲线

图片1.png 

注意:本图仅供参考,应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

 

灵敏度,特异性和重复性:

1.灵敏度:多次重复结果表明,最小检出量为15.4pg/ml

2.特异性:与人的GM-CSFIL-8IL-1β TNF-α及小鼠的TNF-α等没有交叉反应。

3.重复性:板内,板间变异系数均<10%.

 

参考文献

1. Chiang, E.Y. et al. (2009) Nat. Med. 15:766.

2. Warzocha, K. et al. (1995) Eur. Cytokine Netw. 6:83.

3. Seleznik, G.M. et al. (2014) Cytokine Growth Factor Rev. 25:125.

4. Kobayashi, Y. et al. (1986) J. Biochem. 100:727.

5. Mapara, M.Y. et al. (1994) Int. J. Cancer 58:248.

6. Drutskaya, M.S. et al. (2010) IUBMB Life 62:283.


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