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血小板裂解液作为胎牛血清的替代品

背景

间充质干细胞/基质细胞(MSCs)被定义为自我更新的多能祖细胞,能够分化成中胚层来源的其他细胞类型,如脂肪细胞,骨细胞和软骨细胞。

从培养基中分离的MSC显示出一致的表型特征,例如粘附于塑料表面,细胞表面分子CD105CD73CD90的阳性,以及造血标记物和HLA-DR的阴性。以及此共享标志物分布,不同亚群的MSC可以特征的表型和功能异质性 

MSCs 通过体外抑制T细胞增殖  ,通过直接的细胞间接触和通过产生包括一氧化氮在内的可溶性因子发挥有效的免疫抑制和抗炎活性  ,肝细胞生长因子(HGF)和转化生长因子(TGF-β1 ,以及吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO 

使用胎牛血清FBS)和MSC的离体扩增其他动物衍生的已气馁由监管机构,以减少发送朊病毒和其他动物传染病的危险,并且避免在所述异种免疫反应主办。然而,由于缺乏FBS制剂标准化导致细胞培养性能 不一致性和FBS生产已经到来,因为动物福利问题最初提出血小板裂解物(PL)作为动物血清的替代物,用于由Doucet等人体外扩增MSC 包含在PL的生物活性分子和生长因子支持的MSC从骨髓(BM 导出的膨胀,脐带血(UCB ,和脂肪组织(AT ,与FBS相比显示出有利的结果。此外,间充质干扩大了与PL-富集介质已被用于治疗患有激素难治性急性移植物抗宿主病(GVHD)造血干细胞移植后患者和患有几种骨科疾病的患者,主要是中度至重度的膝关节骨性关节炎 

因此,使用PL在无异种条件下分离和扩增MSC可以代表FBS的有价值的替代方案。

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评论

在细胞培养物中生产和使用动物血清

历史上用于培养细胞的动物血清 是具有不同生长促进和抑制活性的生物分子的复合组合。它在培养基中的主要功能是提供刺激细胞增殖的营养因子,并提供转运蛋白,矿物质,微量元素,脂质,附着因子,以及维持pH或抑制蛋白酶和其他有毒分子所需的稳定和解毒元素  FBS是在屠宰场中从健康水坝胎儿中获得的,用于人类消费。FBS优于成年动物的血清,因为其γ-球蛋白含量降低,从而降低了可能的抗体与细胞培养物相互作用的风险。

在这种背景下,2013年出现了一起欺诈案 ,当时发现2003年至2011年期间生产的一些FBS受到标签不合格的影响。

在过去10年中已经进行了识别动物血清替代品大量的努力,其中包括无血清培养基从裂解或人血小板的活化获得 和副产物。然而,替代培养基的使用仍然在很大程度上尚未开发,并且动物血清仍然是例如疫苗生产中的必需成分。

人类PL制剂

从血小板释放生长因子可以通过从血小板单采或从血沉棕黄层获得的富含血小板血浆(PRP)的反复冻融循环来实现(图  1)。简言之,将PRP袋在-80℃下冷冻过夜,然后在+ 37℃下解冻这个循环重复一到三次。在汇集和一个或多个离心/过滤步骤以去除细胞碎片后,PL已准备好添加到生长培养基中(综述于 )。不同实验室采用的制备程序可能因新鲜或过期血小板的使用,冻融循环次数,病原体减少(PR)和过滤步骤而异,导致释放的生长因子的浓度和完整性发生变化。可能与血小板颗粒破坏的功效有关。

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PL和血小板释放制备的程序

Hara等人先前已经描述了产生PL的超声处理。单独或与冻融循环相结合 。超声波是频率≥20kHz的声音。它们的作用是基于液体中超声波的传递,它们产生热和非热效应。对于后者,超声波作用于溶解的气体,其中液体的压缩之后是稀薄的。因此,微气泡与所施加的超声波能量的每个周期扩大,直到它们到达一个不稳定的大小,然后将它们碰撞和/或在名为空化 过程猛烈崩溃。

我们之前已经描述过使用20kHz频率的超声波从新鲜PRP产生PL。在定量血小板衍生的生长因子-ABPDGF-AB)后估计裂解的效率。超声处理30分钟后,74%的PDGF-AB从培养基中的血小板颗粒中释放出来。

血小板因子可以通过生理刺激如凝血酶,胶原,二磷酸腺苷,肾上腺素,和凝血酶受体激活肽 也可被释放,氯化钙2  ,或三ñ丁基磷酸酯和Triton X-45为了获得所谓的血小板释放。用于释放血小板因子的方法是导致最终产品的批次间差异的重要变量,但很少有研究涉及该主题。

已经观察到,用凝血酶(血小板释放)激活血小板后获得的PL和通过血小板冷冻/融化获得的PL刺激了BM衍生的MSC的不同增殖速率。特别地,血小板释放显着加速BM-MSC增殖,以产生在前两次传代中临床相关的细胞数量。MSC质量和功能包括细胞表面标志物表达,脂肪形成和成骨分化以及免疫抑制作用在来自所有培养条件的MSC中是相似的。

我们在含有通过CaCl 2活化产生的10%血小板释放的培养基中扩增BM-MSC ,观察到第8代细胞的累积群体倍增时间约为通过反复冷冻获得的含有10PL的培养基中扩增的相同细胞的两倍。解冻周期。我们没有观察到在两种情况下扩增的细胞的表型和免疫调节特性的任何差异。此外,先前的研究报道,反复冻融循环对生长因子的含量 而负面影响。需要进一步研究以研究不同PL制造技术对细胞扩增,分化和免疫调节的可能影响。

使用过期的血小板单位进行PL生产

由于在临床中对血小板单元的需求而供体有限,因此使用新鲜的血小板单元来产生PL引起了关注。过期的血小板单位可能代表另一种来源,因为有证据表明可以使用从过期单位获得的血小板而不会影响最终产品的质量。

在一个拥有380万居民的意大利地区,2014年生产了大约100,000个来自单一捐赠者的血沉棕黄层单位。其中约60%在有效期后被丢弃。考虑到50ml的平均血沉棕黄层体积,仅使用过期的血沉棕黄层单位可以生产约3000LPL

血小板衍生因子

血小板含有生物活性分子和生长因子,通过物理或生理方法在血小板破坏后从α-颗粒中释放出来。其中包括凝血因子,粘附分子,蛋白酶抑制剂和蛋白多糖,碱性成纤维细胞衍生生长因子(bFGF),表皮生长因子(EGF),HGF,血管内皮生长因子(VEGF),胰岛素样生长因子-1IGF-1),TGF-β1,可溶性CD40L,血管细胞粘附分子-1,细胞间粘附分子-1PDGF-AAPDGF-ABPDGF-BB,趋化因子(CC)配体5和趋化因子(CXC)配体1 / 2/3。所有这些分子都会影响细胞增殖和功能 并且与FBS相比可以促进增殖 

这些因素在细胞扩增中的作用仅有部分了解。中和实验表明,一些血小板因子对于MSC增殖是必需的,因此PDGF-BBbFGF的抑制分别使MSC增殖减少约20%和50 

Kinzebach等人进行了广泛的功能和差异蛋白质组学分析以鉴定影响MSC的体外扩增的血小板衍生因子。 使用MALDI-TOF和蛋白质印迹以及Horn等人。  使用人细胞因子抗体阵列。在Horn等人的研究中,8PL的趋化因子谱与增殖活性相关,显示出增加PDGF-AB浓度的显着正效应。

血小板因子的含量可能因脐带血(CB)或外周血(PB)产生的血小板释放而不同  。使用广泛的蛋白质组学阵列,作者发现几种强烈支持胎儿组织形成的激素如催乳素,黄体酮和甲胎蛋白仅存在于从CB获得的血小板释放中。此外,在CB释放中,作者确定了已知促进血管生成的更高浓度的因子,例如VEGF。相反,蛋白质组学分析显示从PB获得的血小板释放包含更多的促炎因子,例如趋化因子CC4,金属蛋白酶3和趋化因子(CC基序)配体5

使用高通量蛋白质组阵列分析,Crespo-Diaz等人进行了PL的准确蛋白质组学解剖 。在PL的细胞外信号分子中,FGF / EGFTGF-β/骨形态发生蛋白(BMP)和VEGF / PDGF被高度代表。

富含PL的培养基中MSC的分离和离体扩增

在他们的开创性研究中,Doucet等人。在FCS或补充PL的培养基中扩增的MSCs,证明后者促进MSC扩增,从而减少了达到汇合所需的时间,同时与FCS培养物相比增加了成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)的大小。 。在PL存在下培养的MSC保持其三线性分化潜能和它们的免疫抑制活性。

Schallmoser等。 提供证据表明PL可以取代FBS用于MSCs的临床规模扩增。PL在支持MSC扩增方面比FBS更有效,并且尽管形态上不同,但MSC在免疫表型,分化潜能和小鼠致瘤性缺乏方面没有显着差异。

Capelli等人。  证明PL允许从BM吸出物的诊断样品开始临床级产生MSC,或在BM输注结束时使用袋和过滤器残余物。与FBS相比,PL获得了显着更快的扩增。在形态学,分化潜能,表面标志物和免疫学性质方面没有观察到差异。同一作者证明,脐带来源的MSCs也可以在PL中扩展 

MS中免疫调节作用的改变在PL中扩大

PL可能改变某些相关MSC表面分子的表达,削弱它们对T细胞增殖的抑制能力,同种异体抗原和NK细胞增殖和细胞毒性 。还报道了静息和干扰素-γ-引发的BM-MSCAT-MSC的免疫抑制性能降低,以及与FBS相比IDO-1的表达水平减弱。

相反,我们的研究组表明,与在FBS或人血小板血浆(hPPP)中扩增的AT-MSC相比,PL中扩增的AT-MSC对淋巴细胞增殖有更强的抑制作用。此外,Flemming等人。 证明,与其FCS培养的对应物相比,PL中扩增的BM-MSC对淋巴细胞增殖具有相当的抑制作用。Bernardo等人进一步证实了这些数据。

PL生物安全

Crespo-Diaz等人提出了MSC离体扩增期间细胞转化的风险。通过评估在PLFBS中长期培养后BM-MSC的染色体稳定性。值得注意的是,在第12代没有观察到克隆核型异常。

我们小组研究了PL增加的MSC增殖是否会诱导染色体不稳定。令人欣慰的是,正如我们小组 所示,暴露于浓度增加的PL的中国仓鼠卵巢K1细胞系中的微核形成没有变化。通过内源性β-半乳糖苷酶表达评估在含有FBSPL的培养基中培养长达16代的MSC的衰老。将用FBS培养不同数量传代的MSC转换至PL条件以评估PL“拯救”MSC增殖能力的能力。有趣的是,老化和衰老的MSCPL培养显示细胞再生,这反映在倍增时间减少和细胞尺寸减小。此时,这一观察背后的机制尚未阐明 - 但可以推测,特定生长因子如EGF或更可能是PL中生长因子的组合可能介导其对老化MSC培养物的有益作用。

Schallmoser等人研究了FBSPL培养后的基因表达变化 。令人惊讶的是,所有BM-MSC制剂在长期培养后显示出显着的基因表达变化特别是,参与细胞分化凋亡和细胞死亡的基因被上调,而参与有丝分裂和增殖的基因被下调,表明长期扩增诱导了BM-MSC中相似的基因表达变化,而与分离和扩增条件无关。

罗曼等人。分析了供体年龄对PL功能的影响,观察到源自年轻供体的PLMSC增殖显着更高,并且来自较老供体的PL增加了衰老相关β-半乳糖苷酶的活性。

病原体减少

减少病原体的策略

除病毒污染外,血小板单元特别容易受到静脉穿刺部位或供体菌血症的外来病原体的细菌污染。PR因此可以在制造过程中,以降低细菌和病毒载量 实施 。目前的PR技术包括溶剂洗涤剂处理,亚甲蓝/光,核黄素/紫外光或amotosalen /紫外光(Intercept TM)。

虽然PR可能可以降低已知和未知的传染病传播的风险,最近的研究对PR对转录血小板的作用和蛋白质组的报告强调需要进一步的研究,以评估PR中的作用PL的制造过程。

Shih等。比较FBS与失活的PL扩增AT-MSC,得出结论,治疗没有改变分化能力或细胞免疫表型。

基于核酸通过使用补骨脂素加上紫外线光活化过程的破坏血小板捐赠的病原体灭活系统已被开发,用灭活的捐款产生的PL是能够维持BM-MSC扩增和免疫调节。

还通过评估MSC的免疫调节,免疫表型,增殖和三线性分化来测试从用PR系统(Intercept TM)处理和未处理的过期单位开始制备的PL的功能性。有趣的是,结论是由过期和病原体减少的血小板制备的PL支持MSC分化和免疫抑制比未治疗的PL更好 

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结论

已经产生了大量关于制备方式和PL表征的实验室数据,表明与在富含FBS的培养基中扩增的MSC相比,PL中扩增的MSC生长更快。如果将PL的使用升级为制造其他细胞治疗剂或生物制药产品,则对PL的需求可能会急剧增加。在未来的情景中,应该解决几个问题。

供应

每年FBS可用性估计约为500,000-600,000 L /年,其中约1/3是适合于良好生产规范(GMP)生产。近年来,血清的年需求量下降主要是因为疫苗的生产已转向使用无血清微生物或哺乳动物细胞培养物 。与此同时,由于疫苗行业需求减少以及为牛肉和奶制品饲养的大量牛只,全球动物血清的产量和可用性都在下降  ,从而限制了该产品的可访问性。牛血清的要求和产量的下降与细胞治疗和再生医学产品的需求增加同时发生。因此,全球献血的可用性需要涵盖临床需求,细胞制造和研究  。在这种情况下,即使缺乏商定的质量标准,过期的血小板单位也可能成为PL的主要来源。主要由学术界和越来越多的血库推动的PL生产,表征和测试过程很难与现在提供GMP生产的PL的工业制造商竞争。

处理

已经提出了几种从血小板释放生长因子的方法,导致不同的释放效率和PL效力。应对所用方法的标准化达成共识。

发布标准

即使一些研究表明某些特定细胞因子在PL中具有重要作用,但迄今为止尚未找到共识。一个问题是相同的细胞因子含量是否对不同细胞类型是关键的。从这个意义上说,PL定义的基本步骤之一是指定发布标准。

PL或释放生产方法似乎在产品的最终组成中起作用,可能调节从血小板颗粒释放的因子的数量和质量。PL中细胞因子和生长因子的最终浓度也可能与合并的血小板单位数和最终血小板浓度有关。

由于PL含有血浆和血小板蛋白质组,因此制剂中人免疫球蛋白GIgG)的浓度可在812 mg / ml之间变化  ,也可能与最终产品中的生产过程和血浆浓度有关。 。为了降低由细胞制剂中高浓度的同种异体IgG引起的患者副作用的风险,应该定义PL制剂中的IgG浓度。

在发布产品之前,将参考MSC制备扩展到至少与FBS相当的预定水平的能力可能是评估PL质量的措施。应保持在PL或释放中扩增的MSC的免疫调节特性,并且开发用于评估该功能的标准测定将是有利的。释放标准还应包括内毒素含量以及病毒和细菌安全性。

总之,我们已经确定了定义PL的实质性需求以及了解介导PL对细胞生长的有益作用的机制。迫切需要科学社团,最终用户,血液中心和工业界的合作努力来提高我们的知识。

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缩略语

AT,脂肪组织; bFGF,碱性成纤维细胞衍生生长因子; BM,骨髓; BMP,骨形态发生蛋白; CB,脐带血; CFU-F,成纤维细胞集落形成单位; EGF,表皮生长因子; FBS,胎牛血清; GMP,良好生产规范; GVHD,移植物抗宿主病; HGF,肝细胞生长因子; hPPP,人血小板血浆; IDO,吲哚胺2,3-双加氧酶; IGF-1,胰岛素样生长因子-1; IgG,人免疫球蛋白G; MSC,间充质干/基质细胞; PB,外周血; PDGF,血小板衍生生长因子; PL,血小板裂解液; PR,病原体减少; PRP,富含血小板的血浆转化生长因子,转化生长因子; UCB,脐带血; VEGF,血管内皮生长因子

 


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