细胞冷冻保存

1.材料:

生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO (Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020) 、0. 4%

( w/v) trypan blue (G ibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRY010SeriesII)

2、冷冻保存方法:

(1)传统方法:冷存管置于4C10分钟-->-20C30分钟-->-80C 16~ 18小时(或隔夜)-->液氮槽vaporphase

长期储存。

-20C不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80C冰箱中，惟存

活率稍微降低一些。

(2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3C/分钟之速度由室温降至(-80C以下) -120C，再放

在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

(3)HAKATA无血清细胞冻存： 加入HAKATA无血清细胞冻存液制成悬液，直接冻于-80°C，可保存≥5年。

3、步骤:

(1)冷冻前24-48小时更换半里或全里培养基，使细胞处于指数生长期。

(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚矾(DMSO)至20%

浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。

(3)离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少里细胞悬浮液(约0.1m1)计数细胞浓度及冻前

存活率。

(4)取与细胞悬液等里的冻存液，缓慢逐商加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液( DMSO最后浓度为

5~ 10%)，使细胞浓度为1~5x 10*cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1~ 2nl/mal,并取.

少里细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。

4、注意事项:

(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80~90%致密度。冷冻前检则细胞是

否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

(2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。

(3)注意冷冻保护剂之品质。DISO应为试剂级等级，无菌且无色以0. 22micron FGLP Telflon过滤或是直

接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~ 10mI小体积分装，4C避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂

级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻

存液，可避免DMSO直接加入时释放的热里对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高参，可降低细

胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。

(4)冷冻保存Z细胞浓度:

①normal human fibroblast : 1~ 3x 10'ce1ls/ml

②hybridoma: 1~3x 10*cells/m1,细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死

去。

⑤adherent tumor lines:5~ 7x10，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1~

3x 10'cells/ml

⑨other suspensions:5~ 10X 10'cells/ml，human lymphocyte 须至少5X 10'cells/ml。

(5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO, 若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup

culture,以防止冷冻失败。

(6)冻存可用10%~90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而

少沉积(4 度时)，复苏存活率在80%~90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。