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细胞冻存液的配方是什么

细胞冻存液的配方是什么

细胞深低温保存的基本原理是:在-70℃以下时,细胞内的酶活性均己停止,即代谢处于完全停止状态,故可以长期保存。细胞低温保存的关键,在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内,水晶呈针状,极易招致细胞的严重损伤。 总的原则是缓慢冻存!!!
 材料:

生长良好之培养细胞 ,新鲜培养基,  DMSO ,无菌塑料冷冻保存管,血球计数盘与盖玻片 

二步骤:

2.1 冷冻前一日前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形,最好细胞应该处于对数生长期。
2.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制):将DMSO 加入新鲜培养基中,最后浓度为5-10%,混合均匀,置于室温下待用。 
2.3. 依细胞传代培养之操作,收集培养之细胞与冻存管内,取少量细胞悬浮液(0.1 ml) 计数细胞浓度。 

2.4. 先将冻存管放入4冰箱,约40min

2.5 接着置于-20冰箱,约30-60min

2.6. 置于-80超低温冰箱中放置过夜。

2.7. 置于液氮罐中长期保存。

2.8 同时做好冻存记录,在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。


 注意事项:

3.1.使用DMSO前,不需要进行高压灭菌,它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破坏它的分子结构,以至于降低冷冻保护效果。

在常温下,DMSO对人体有害,故在配制时最好戴上手套操作。

混合DMSO要快,因为DMSO对细胞有毒性,混合之后应尽快冻存提醒各位注意的是加入冻存液后一定要混匀,防止DMSO沉淀

冻存液比例培养基7:血清2DMSO1,也有将血清比例加大的做法,有的甚至将血清提高到90%,具体浓度视经验而定,但是好多人认为胎牛血清含量越高越好!

常用的细胞冻存液配方为:

    20%血清(FBS)、10%DMSO、70%培养基;

    或90%血清(FBS)、10%DMSO,更可防止细胞内冰晶形成。


3.2.不宜将冻存细胞放置在0-60这一温度范围内过久,低温损伤主要发生在这一温度区内,是危险温区 

可以先在泡沫上打孔,把冻存管塞进去。这样降温可以慢一点,当然包上棉花也是不错的主意

3.3.注意定期检查液氮罐内液氮量,及时添加。

3.4  -20°C 不可超過 1 小時,以防止冰晶過大而造成細胞大量死亡。

3.5 冷凍管內細胞數目一般至少為10*6-7/ml 以上冻存细胞健康程度 一般要求活细胞在95%以上,细胞活力差的在冻存后的成活机率很小,因此,一定要在细胞旺盛分裂时期冻存
3.6 细胞冻存管一般有1.5-2ml左右体积,原则上可以存放1.5ml充满均匀悬浮细胞的冻存液,一些人喜欢灌注1-1.5ml冻存液冻存,这实际上并不好。

原因如下:冻存液冻存需要一段时间,如果这段时间冻存管倾斜,液体容易流到管口,很容易在后续的操作中造成污染。

建议0.5-1ml之间即可。但是还是用1.5ml的话,具体操作时,冻存管直立起来放在-20的冰箱里,这样不容易造成污染。
同时冻存细胞的时候,一定加上封口膜,这样可以避免复苏的时候,水浴箱里的水进入盖子的缝隙中!

冻存管外面用封口膜封上后,最好再用白胶布再封一下。

这样可以防止细胞复苏时,封口膜崩裂,水浴箱中的水进入冻存管。


3.7 提醒;不要将细胞冻存在-4度,或-20时就忘了,很心疼。


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