材料：

磷酸盐缓冲盐水（PBS）

胰蛋白酶/ EDTA溶液

组织培养基

细胞冻存液（通常为10％二甲基亚砜，DMSO）

带标签的冷冻管（每100毫米板约3个）

100毫米的融合细胞板

冻结程序：

预冻存

1）在显微镜下检查细菌，酵母或真菌污染。

2）测试支原体样品。

冻存

3）胰蛋白酶消化细胞（标准方案）。

4）将细胞重悬于培养基中，转移至无菌离心管中，以1000RPM和4℃离心3-5分钟。

5）用无菌巴斯德吸管移除上清液。

6）通过每瓶加入1ml细胞冻存液快速重悬颗粒以冷冻。

7）每瓶1ml细胞冻存液加细胞，置于冰上。

8）在-80℃下冷冻过夜。

9）将小瓶转移到液氮罐中以无限期储存。

后冻结

10）从液氮罐中取出小瓶，并按照下面的解冻程序测试冷冻是否成功。

复苏程序：

1）温热的组织培养基，不选择抗生素至37℃，并标记100-mm组织培养板。

2）从液氮罐中取出小瓶并在37℃水浴中保持，直至两侧解冻但中心仍然冷冻。

3）轻轻地将细胞倒入板中。不要摇动小瓶。

4）向部分冷冻的细胞中滴加9ml温热的培养基。

5）将板放入培养箱中。

6）细胞附着后立即更换培养基（去除DMSO ）。