下面的方案描述了细胞冻存方法的使用，其涉及-80℃超低温冰箱用于冷冻保存细胞系。ECACC通常使用可编程的速率控制冷冻机。这是冻存细胞最可靠和可重复的方法，但由于此类设备的成本超出了大多数研究实验室，因此下面的方法将详细描述。如果定期冷冻大量细胞培养物，则建议使用可编程的速率控制冷冻机。

物料

• 细胞冻存液（通常为90％FBS，10％DMSO或甘油

• 无菌水中70％的酒精

• 不含Ca2 + / Mg2 +的PBS

• HBSS中0.05％胰蛋白酶/ EDTA，不含Ca2 + / Mg2 +

• DMSO

设备

• 个人防护设备（无菌手套，实验室外套）

• 全脸防护面罩/遮阳板

• 水浴温度设定为37°C

• 微生物安全柜在适当的安全壳水平

• 离心分离机

• 血细胞计数器

• 预先标记的安瓿/冷冻管

• 细胞冻存设备

• 关键点

• 最常用的冷冻保护剂是二甲基亚砜（DMSO），然而，这不适用于所有细胞系，例如HL60，其中DMSO用于诱导分化。在这种情况下，应使用甘油等替代品（有关正确的冷冻保护剂的详细信息，请参阅ECACC数据表）。

• 上面推荐的细胞冻存液已被证明是大多数细胞类型的良好通用培养基。另一种常用的细胞冻存液配方是：70％基础培养基，20％FBS，10％DMSO，但这可能不适用于所有细胞类型。在定期使用之前，检查它是否适用于您的细胞。

• 文化是健康的并且处于生长的对数阶段是至关重要的。这可以通过使用预融合培养物（低于其最大细胞密度的培养物）和通过在冷冻前24小时更换培养基来实现。

• 冷却速率可以变化，但作为一般指导，-1℃至-3℃/分钟的速率将证明适合于大多数细胞培养物。

• 弗洛伊特先生系统的另一种选择是Taylor Wharton被动式冷冻机，其中安瓿瓶内的杜瓦瓶中的液态氮蒸气。该系统允许安瓿逐渐降低，从而降低温度。速控冰柜也是可用的，如果定期冷冻大量安瓿，它们特别有用。

• 作为最后的手段，如果没有其他装置可用，可以将安瓿放在隔热良好的盒子内（例如边长至少1cm的聚苯乙烯盒子）并放置在-80℃过夜。重要的是确保盒子在整个冷冻过程中保持直立。冷冻后，应将安瓿转移到液氮储存容器的气相中并记录位置。

• 如果使用涉及-80°C冰箱的冷冻方法，则必须为细胞系冷冻分配部分，以便不会无意中去除样品。如果这发生在冷冻过程的关键部分，那么可行性和回收率将受到不利影响。

• 程序

• 使用倒置显微镜观察培养物以评估细胞密度并确认不存在细菌和真菌污染物。在对数生长阶段收获细胞。对于贴壁细胞系，收获细胞尽可能接近80-90％汇合。

• 如前所述，使用胰蛋白酶/ EDTA将粘附和半粘附细胞悬浮于悬浮液中，并重新悬浮于至少相当于胰蛋白酶体积的一定体积的新鲜培养基中。悬浮细胞系可以直接使用。

• 取出一小部分细胞（100-200μl）并进行细胞计数。理想地，细胞存活率应该超过90％，以便在冷冻后实现良好的恢复。

• 将剩余的培养物以150xg离心5分钟。

• 在细胞冻存液中以每毫升2-4×10 ^6个细胞的浓度重悬细胞。

• 将1ml等份的细胞移液到已用细胞系名称，传代数，批号，细胞浓度和日期标记的冷冻保护安瓿中。

• 将安瓿放入被动冷冻室，例如Nalgene先生Frosty冷冻容器。用异丙醇填充冰箱并在-80℃下放置过夜。

• 冷冻安瓿应转移到液氮储存容器的气相中并记录位置。