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HUVEC细胞冻存和复苏的最佳方法是什么?细胞冻存液?

一年前,我冻存了一些含有10%DMSO和90%FBS的HUVEC(细胞冻存液)。当解冻时,我将其置于水浴中直至大部分解冻,然后将温热的EGM-2加入到冷冻管中,然后转移至含有几毫升温热培养基的15mL Falcon。然后我旋转并重新悬浮并放入涂层的T-25但没有附着细胞。其他人如何冻存复苏HUVEC?

 

这是我们每天在实验室中使用的步骤。我们使用Frosty先生的冷冻容器在-80°C冰箱中温和冷冻细胞。然后将冷冻的细胞转移到液氮中储存。 

冷冻混合

•热灭活的FCS(我们使用来自Hyclone的FCS)含有10%DMSO(组织培养级,无菌)。

•在4°C下保持无菌状态。

冷冻

•将Frosty先生的冷冻容器预先冷却至4°C。

•在冰上预冷冷冻介质。每瓶需要~1毫升。

•用HUVEC生长培养基平衡50ml管(HGM:在我们的情况下,来自Lonza的EGM-2,补充有FCS至18%终浓度FCS)至RT。

•吸出培养基,冲洗1次RT PBS,吸出然后胰蛋白酶消化细胞。确保细胞已分离。

•用HGM中和胰蛋白酶。仔细但完全地重悬细胞。

•将细胞悬浮液转移至15 ml Falcon试管中。

注意:我们通常会冷冻含有~5 * 10 ^ 5个细胞的小瓶,因此我会在制粒前计算细胞数(为了粗略确定所需的冷冻混合量)细胞冻存液

•离心机中的沉淀细胞(室温下5-7'150 g)。

•吸出培养基并将颗粒放在冰上。

•将冷冻介质加入颗粒中。通过上下移液重新吸取。 

•将细胞悬液分装到冷冻瓶中,然后将瓶子转移到Frosty先生身上。

•将Frosty先生放在-80°C冰箱中,至少保存一夜。

•将冷冻细胞转移到液态N 2或低温生物学设施。

解冻

•准备一个涂有明胶或胶原蛋白的培养瓶。我将含有500K细胞的小瓶放入T75烧瓶(约75cm 2表面)中。

•准备1管12毫升HGM,并在37°C温暖。

• 在37°C的水浴中从液态N 2中解冻1瓶HUVEC 。

•当细胞悬浮液几乎但未完全解冻时,将其与12 ml HGM一起从水浴中取出,并用70%乙醇喷雾小瓶和试管。

•放入组织培养罩并擦去多余的乙醇。

•将样品瓶的内容转移到HGM。

•转移到明胶/胶原蛋白涂层烧瓶中。 

•将烧瓶放入37°C,5%CO 2培养箱中。在一天结束时更换培养基以从冷冻混合物和未附着的细胞(不是很多)中去除DMSO。 细胞冻存液

 

细胞冻存液


上述的步骤很繁琐,也很古老

 如果使用HAKATA无血清细胞冻存液,那么你只需要将冻存液从4°C冰箱中取出来使用,

冻存管直接放于-80°C过夜,在转移只液氮中就可以了。



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