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如何进行贴壁细胞的细胞冻存和复苏?

我正面临冻存贴壁细胞(HepG2HUCCT1)的问题。我不知道如何冻存和复苏的方法

在我开始新的培养后,细胞不会附着在培养皿上。他们可能已经死了!

谁能告诉我一个好的细胞冻存/细胞复苏


 

一般而言,当您制作细胞库/冷冻细胞时,您应用的原则似乎适用于大多数哺乳动物细胞培养系统。我必须承认,900 uL血清和100 uL DMSO过量,但您正在应用90%血清和10%DMSO 细胞冻存液,这很好。

正如一些人已经评论过的,一些实验室使用不同的冷冻培养基混合物,如70%培养基,20%血清和10%DMSO。这就是我用于哺乳动物细胞培养的方法。但考虑到你的冷冻媒体似乎没有明显的问题,我建议你看看早期的部分。

这样的部分将是:细胞传代数(你决定用它来创建你的细胞库 - 通常是第7-9段是最好的细胞培养物使用,而大多数细胞超过20次传代应该被丢弃),细胞密度/ mL(标准通常> 1,000,000 / mL),前的任何明显污染,冷冻培养基中使用的血清年龄,所用血清的来源(血清从原产地到同一来源的均匀分批变化很大),冷冻机制(使用慢速冷冻 - 先生Freezey iso-proponal冷冻装置),最后你的解冻方案。

任何标准解冻方案应该在37℃解冻时快速进行,然后进行初始平板加上使用的解冻培养基。我将解冻的细胞在80%培养基+ 20%血清(无抗生素)中培养2小时。然后用温PBS(不含Mg2 +或Ca2 +)彻底洗涤以除去DMSO,然后加入更多的解冻培养基孵育24小时。在此之后,您应该将介质更换为正常的培养基,在第一次通过前离开24-48小时。

我的正常程序是使用HAKATA无血清细胞冻存液

移液到冷冻管,快速工作。

接下来,直接冻存直接放置在-80℃冰箱中。然后根据需要转移到液氮中。

为了解冻,在37℃浴中快速加热,转移到管中,慢慢加入培养基,直到你有你想要的体积 。我第二天更换了培养基,但是对于一些细胞,最好立即离心并更换培养基。

编辑:坦率地说,回顾过去,这种方法是导师教给我的方法,但我没有强有力的证据表明这一点至关重要。我总是这样做,结果很好,所以我坚持下去。

细胞冻存液


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