我正面临冻存贴壁细胞（HepG2和HUCCT1）的问题。我不知道如何冻存和复苏的方法

在我开始新的培养后，细胞不会附着在培养皿上。他们可能已经死了！

谁能告诉我一个好的细胞冻存/细胞复苏？

一般而言，当您制作细胞库/冷冻细胞时，您应用的原则似乎适用于大多数哺乳动物细胞培养系统。我必须承认，900 uL血清和100 uL DMSO过量，但您正在应用90％血清和10％DMSO 细胞冻存液，这很好。

正如一些人已经评论过的，一些实验室使用不同的冷冻培养基混合物，如70％培养基，20％血清和10％DMSO。这就是我用于哺乳动物细胞培养的方法。但考虑到你的冷冻媒体似乎没有明显的问题，我建议你看看早期的部分。

这样的部分将是：细胞传代数（你决定用它来创建你的细胞库 - 通常是第7-9段是最好的细胞培养物使用，而大多数细胞超过20次传代应该被丢弃），细胞密度/ mL（标准通常> 1,000,000 / mL），前的任何明显污染，冷冻培养基中使用的血清年龄，所用血清的来源（血清从原产地到同一来源的均匀分批变化很大），冷冻机制（使用慢速冷冻 - 先生Freezey iso-proponal冷冻装置），最后你的解冻方案。

任何标准解冻方案应该在37℃解冻时快速进行，然后进行初始平板加上使用的解冻培养基。我将解冻的细胞在80％培养基+ 20％血清（无抗生素）中培养2小时。然后用温PBS（不含Mg2 +或Ca2 +）彻底洗涤以除去DMSO，然后加入更多的解冻培养基孵育24小时。在此之后，您应该将介质更换为正常的培养基，在第一次通过前离开24-48小时。

我的正常程序是使用HAKATA无血清细胞冻存液

移液到冷冻管，快速工作。

接下来，直接冻存：直接放置在-80℃冰箱中。然后根据需要转移到液氮中。

为了解冻，在37℃浴中快速加热，转移到管中，慢慢加入培养基，直到你有你想要的体积 。我第二天更换了培养基，但是对于一些细胞，最好立即离心并更换培养基。

编辑：坦率地说，回顾过去，这种方法是导师教给我的方法，但我没有强有力的证据表明这一点至关重要。我总是这样做，结果很好，所以我坚持下去。