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小秋分享:细胞培养时注意事项(下)

收到冻存细胞后如何处理?
1、首先,收到细胞时,请检查泡沫箱内干冰是否剩余、细胞冻存管是否有解冻情况,若出现细胞解冻情况,请拍照,并及时与技术支持联系(所拍照片将作为售后服务依据);若细胞冻存管正常,细胞株请尽速开始培养或立即冻存保存(置于-80℃冰箱,隔夜放置后,移至液氮罐中保存),需要时,复苏培养即可。
2、准备好37℃水浴锅,并准备好细胞完全培养基(温育至37℃);
3、在15ml离心管中加入9ml细胞完全培养基(温育至37℃);
4、将装有冻存细胞的冻存管从液氮罐中取出,立即放入37℃水浴中;
5、在37℃水浴中快速晃动细胞冻存管,使得冻存管中内容物尽快融化;仔细观察,待冻存管中内容物完全融化后取出;注意:①尽可能避免水没过管帽,以减少污染的风险;②要快速完成细胞复苏过程(尽量控制在1分钟内),融化过程时间过长,会造成复苏后细胞活性较差。
6、用70%75%酒精消毒冻存管外壁,在超净台中打开冻存管,用吸管/移液器将细胞冻存悬液移入装有9ml细胞完全培养基的15ml离心管中(在这一过程请尽可能避免产生气泡)。
7为了减少细胞损失,往细胞冻存管中加入1ml完全培养基,稍微吹打,用吸管/移液器将这1ml的细胞悬液吸入离心管中,再用吸管/移液器将离心管中的细胞轻轻吹打混匀。
8、以250×g的离心力(约1200-1350rpm)将细胞悬液离心3-5分钟。
9、离心后,检查上清液是否清澈,有无完整的细胞沉淀;在超净台内,尽量去除上清液,向细胞沉淀物加入1-2ml的完全培养基(温育至37℃),轻轻吹打混匀。
10、将细胞全部接种至1T25细胞培养瓶或60mm无菌塑料培养皿中,加入6-8ml细胞完全培养基;轻轻摇晃细胞培养器皿,使细胞均匀分布。
11、置于37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中静置培养。
12之后,参照细胞说明书换液频率给细胞换新鲜的完全培养基(温育至37℃),直到细胞达80%的汇合度;当细胞达80%-90%的汇合度,可参照细胞说明书传代比例进行消化、传代。
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