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细胞冻存的小常识

必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。

细胞复苏步骤

一.实验前准备:
将水浴锅预热至37℃。
细胞实验室进行常规消毒,用75%酒精擦拭并且使用紫外线照射40min的超净工作台台面。
在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等。

二.取出冻存管:
根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。

三.迅速解冻:
迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻,并要不断地摇动,使管中的液体迅速融化。
约1-2min后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再拿入超净台内。

四.平衡离心:
用架盘天平平衡后,放入离心机中1000r/min,离心5min。

五.制备细胞悬液:
吸弃上清液。
向离心管内加入10ml预热的培养液,吹打制成细胞悬液。
用培养液悬液混悬沉淀细胞,调整细胞浓度,放培养箱中培养。

六.细胞计数:
细胞浓度以5×105/ml为宜。

七.培养细胞:
将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内,将培养瓶放入37℃,5%CO2的培养箱内2-4小时(或者24-48小时)后换液继续培养,换液的时间由细胞情况而定。

八. 记录复苏日期:
细胞冻存和复苏是细胞培养技术里面容易出问题的部分,因此必须注意以下几点~

注意无菌操作。
取细胞的过程中可能会接触液氮,一定注意带好防冻手套,护目镜。
此项尤为重要,如果冻存管密封不严,细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时,在水浴中摇晃,冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸,所以,一定要戴保护眼镜和手套,复苏过程中应盖上恒温水浴锅的盖。
应在1-2min内使冻存液完全融化。如果复温速度太慢,则会造成细胞损伤。另外,细胞复苏后的操作Hao在4℃冰浴中进行,以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。
复苏过程中,升温的速率要大,把从液氮取出的细胞在短的时间内放入水浴锅。
离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高,注意加入少量培养液可稀释其浓度,以减少对细胞的损伤。

细胞贴壁少的问题:教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml-15ml培养液,经验总结,培养基越少细胞越容易贴附。
复苏细胞分装的问题:复苏1管细胞一般根据情况可分装到1-2只培养瓶中,分装过多,细胞浓度过低,不利于细胞的贴壁。
加培养基的量放入问题:这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度,从如果加培养基的太少,DMSO的浓度就会比较大,就会影响细胞生长,从以前的资料来看,DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响。还有一个说法是1%。所以如果冻存液的浓度是10%DMSO,那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

初学者易犯的错误:
水浴锅未预热或者未预热到37℃直接融化。
水浴锅内冻存管太多,导致传热不佳,使融化时间延长。
离心前忘记平衡,导致离心机损坏和细胞丢失。
一次复苏细胞种类过多,忘记更换吸头和吸管,导致细胞交叉污染。
解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清。因为每一种细胞都有自己特定的,并且已经熟悉了的生长环境。突然使用不一样的培养液和血清,会造成细胞生长不良,甚至死亡,像水土不服一样。

结果分析:
判断细胞复苏成功与否,需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率(细胞存活率将冻存管内剩余的细胞,用台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞,活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞,得出细胞存活率)。如果复苏后95%以上的细胞贴壁,而且细胞的活性好,这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长,达到正常的生长特性(比如细胞群体倍增时间等)后要再冻存以补充细胞储存数量。

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