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原代细胞的提取方法详细步骤

原代细胞是通过一定的方法如酶法或机械法或生长法使细胞从人体和动物的母体器官、组织或液体中分离出来,并在受控环境条件下分离的细胞在体外或其他人体和动物体内生长。

原代细胞的提取方法详细步骤:

1)整个操作要在洁净通风的超净台下进行,所有的器材要高压消毒。

2)根据BALB/c小鼠的体重,用10ml/kg3%浓度的戊巴比妥钠麻醉;将小鼠置于盛有75%乙醇的烧杯内,这一步不仅可以消毒,也可以让小鼠体毛浸湿,后续剃去皮毛的时候不会沾到剪刀或组织上。

3)用镊子轻轻挑起小鼠的心脏,装有PBS的注射器插入心尖,同时在右心耳处剪开一个小口,缓慢推动注射器,随着心脏的跳动,将体内的血液冲洗出来。

4)取出小鼠的肺部组织,将肺组织切成小米粒样的大小,置于预冷的HBSS中反复冲洗几次。

5)将小米粒大小的肺组织置于培养瓶中(培养瓶前一天用1%明胶溶液包被培养面,4度过夜,小鼠处理前,将培养瓶放置培养箱中,使其温度恢复至37度),置于培养箱37度的环境下,消化4个小时。

6)消化4小时后,加入培养基(添加培养基,可以是正常培养时的2倍量),继续培养24小时(继续培养的时间可根据细胞贴壁情况适当调整)。

7)24小时后,取出肺组织,镜下观察细胞状态,换液。

8)原代细胞的提取和培养是很慢的过程,一般需等到24小时后,才能在镜下看到些许细胞群,一周到两周后才会看到鹅卵石样的排列情况。

9)原代细胞2-3天换液一次,因为内皮细胞生长形成单层时,会出现接触抑制现象。所以,内皮细胞生长接近单层时就可以传代了,不要等到长得非常满。

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